codugenetic.do.am

GENA EWS (Sarcomul EWING)

codugenetic — Sun, 24 Aug 2008 11:48:36 GMT

Autori: Dumitru Miscalencu; Camelia Iancu; Florica Mailat; Ilinca Nicolae articol preluat de pe www.ebooks.unibuc.ro

Oncoproteina EWS este caracteristica celulelor tumorale ale sarcomului Ewing - o tumora maligna cu structura polimorfa-. În multe cazuri de cancer, rearanjarea cromosomilor specifici tumorali induce aparitia de produse himerice care au abilitatea de a transforma celulele.
Tumorile care apartin familiei Ewing prezinta translocatii recurente constând în fuziunea genei EWS din cromosomul 22q 12 cu diferiti membrii ai factorilor de transcriere FLI-1, ERG, ETV-1, E1AF si FEV. Unii din acesti factori sunt membrii si ai familiei ETS. Transcriptele hibrid cele mai frecvente în celulele tumorale Ewing sunt: EWS/FLI-1. Aceasta gena de fuziune rezultata din translocatia t(11;22) joaca un rol cheie în patogeneza sarcomului Ewing.
Transcripte hibrid s-au detectat si în celulele tumorale gigante dintr-un neoplasm de os, cu caracter intermediar între leziunile benigne si maligne. În 13 din 15 cazuri de asemenea tumori cu celule gigante, prin tehnica PCR “semi-nested” s-au detectat produse himerice dupa doua cicluri de amplificare. Prezenta acestor produse a fost confirmata în 3 din 8 culturi primare din aceste tumori, în care s-a detectat acelasi tip de transcripte hibrid observata si în proba de tumori primare. Secventierea acestor transcripte demonstreaza prezenta componentelor EWS si FLI în produsele himerice.
Aspectele mentionate mai sus ofera un model de studiu pentru mecanismele formarii genelor de fuziune EWS/FLI în tumorile de origine mezenchimala. Gena de fuziune EWS/FLI poate functiona ca un factor de transcriere cu aceeasi specificitate de cuplare la DNA ca si FLI-1. Atât EWS cât si gena de fuziune se pot asocia cu holoenzima polimeraza RNA II, ca si cu SF-1 (factor de procesare esential).
Proteina U1C, una din cele trei proteine mici nucleare U1,- specifice ribonucleoproteinelor interactioneaza cu EWS si EWS/FLI, atât in vitro cât si in vivo. De asemenea, U1C interactioneaza si cu alti factori de procesare, intervenind astfel în stadiile timpurii ale dezvoltarii. Coexpresia EWS/FLI-U1C represeaza transactivarea mediata de gena hibrid sugerând ca aceasta interactiune poate avea semnificatii functionale. De aici concluzia ca U1C ca proteina de procesare poate functiona si în reglarea transcriptionala. Se sugereaza astfel ca, gena EWS si gena hibrid EWS/FLI pot functiona atât în procesele de transcriere cât si în cele posttranscriptionale.
Familia tumorilor sarcomului Ewing include si tumora neuroectodermica periferica, definita genetic prin translocatii cromosomiale specifice care conduc la fuziunea genei EWS cu un membru al familiei genelor de transcriere ETS cum este FLI-1 (90-95%) sau ERG (5-10%). Tipul cel mai comun al transcrierii prin fuziune este tipul 1 EWS/FLI –1 care este asociat cu o prognoza favorabila, deoarece codifica un activator functional mai slab comparativ cu alte tipuri de fuziune. Indexul proliferarii Ki-67 este mai înalt în cazul EWS/ERG decât în cazul EWS/FLI-1.
Translocatia t(11;22) (q24;q12) este un marker molecular specific pentru tumorile familiei sarcomului Ewing. Pe baza acestei translocatii se presupune ca unele neuroblastoame olfactive apartin, de asemenea, acestei familii. Totusi, din 13 asemenea tumori numai una a prezentat gena de fuziune EWS/FLI-1.
Rearanjarea genei EWS cu FLI-1 apare timpuriu în patogeneza tumorilor din familia sarcomului Ewing, deoarece aberatia cromosomiala este patognomica pentru sarcomul Ewing. Proteina adenovirala Ad.5 E1A induce acest rearanjament în numeroase tipuri celulare, ceea ce sugereaza un rol etiologic al agentilor virali în generarea aberatiillor cromosomiale oncogenice, dar în acelasi timp, poate avea un impact semnificativ pentru folosirea vectorilor adenovirali în terapia genica. Pe de alta parte, se arata absenta produselor himerice EWS-FLI-1 din culturi pe termen scurt sau lung de linii stabil trnsformate de adenovirus, ca si din liniile care exprima tranzitoriu E1A. Se demonstreaza si absenta lui E1A din tumorile familiei sarcomului Ewing. De aici, concluzia ca adenovirusul nu intervine în patogeneza acestei tumori si deci, rearanjarea genelor specific tumorale nu este influentata de adenovirus.
O alta translocatie t(12;22) constatata frecvent în sarcomul cu celule clare induce fuzionarea genei pentru proteina sarcomului Ewing cu factorul activator al transcrierii (ATF-1). Experimentele cu anticorpi anti-ATF-1 arata ca proteina de fuziune EWS/ATF-1 are un rol direct în mentinerea viabilitatii celulelor acestui tip de sarcom si, de asemenea, ca anticorpii ar putea fi folositi pentru blocarea proteinei tumorale.
Oncoproteina celulara a sarcomului Ewing (EWS) si ATF sunt markeri înalt specifici pentru melanomul malign al structurilor moi, fiind în acelasi timp un potent activator al câtorva promotori ce induc cAMP, asa cum este promotorul somatostatin. S-a explorat în celulele melanomului potentialul acestui promotor asupra expresiei toxice a genelor. Când în aceste celule se introduce gena de fuziune somatostatin-TK HSV, aceasta le confera o puternica sensibilitate specifica celulei, la ganciclovir –un prodrog citotoxic-. Aceasta sensibilitate presupune prezenta locului ATF-binding în promotorul somatostatin sugerând ca expresia genei toxice este cauzata de hibridul EWS/ATF-1. Astfel se releva potentialul de utilizare a promotorului somatostatin pentru terapia citotoxica a prodrogului în celulele melanomului malign.
Prezenta unor domenii SH3 de interactiune în terminusul NH2 al EWS creste potentialul hibridului EWS/WT-1 (WT-1 este o gena supresoare de tumori). Se constata ca EWS/WT-1 se poate asocia cu domeniul SH3 al câtorva proteine inclusiv v-src. Expresia ectopica a v-src fosforileaza in vivo EWS/WT-1 si amplifica abilitatea de transactivare a domeniului NH2-terminal EWS. Alterarea structurii domeniilor v-src SH2 sau SH3 produce mutante care nu pot interactiona cu EWS/WT-1 si nici nu pot creste capacitatea transcriptionala a EWS.
Se sugereaza posibilitatea ca unele proprietati transcriptionale ale EWS/WT-1 ar putea fi reglate pe o cale de semnalizare citoplasmatica. In vivo EWS/WT-1 este fosforilata la reziduurile serina si tirozina, ceea ce afecteaza cuplarea la DNA. Poate, de asemenea, interactiona cu c-abl prin modificarea unor reziduuri de tirozina. Fosforilarea tirozinei EWS/WT-1 de catre c-abl regleaza negativ capacitatea sa de cuplare la DNA. Prin urmare, activitatea biologica a EWS/WT-1 este intim legata de statutul fosforilarii sale.
Tot mai frecvent se constata ca diferite clase de proteine care cu pleaza la DNA, asa cum sunt ATF-1, WT-1 si CHOP, fuzioneaza cu EWS în diferite fenotipuri tumorale. Astfel, s-a detectat o noua translocatie si anume translocatia t(1;22) ( q35.1;q12) cu gena numita ZSG (Zinc finger Sarcoma Gene) ce codifica proteina Zinc-finger- Cys2-His-2- care contine un domeniu transcriptional represor-like la N-terminus. Rearanjarea implica intronul 8 al EWS si exonul 1 al ZSG creind o secventa lineara ce contine domeniul transactivator al EWS fuzionat cu domeniul Zinc-finger al ZSG. Acestui produs îi lipseste domeniul represor transcriptional la N-terminus al ZSG.
S-a demonstrat experimental actiunea proteinelor de fuziune EWS cu un produs ETS. In vitro, liniile policlonale stabilizate exprima doua diferite gene EWS-ETS; fie EWS/FLI-1, fie EWS/ETV-1, care induc expresia genei citocheratinei 15. Injectate la soarecii SCID-CB-17, ambele gene de fuziune induc si schimbari morfologice, histologice si ultrastructurale în fibroblastele NIH 3T3. Celulele native cu morfologie fusiforma se transforma în celule poligonale cu rata N/P înalta si care exprima abundent citocheratina. Acest model murin creiat în celulele NIH 3T3 derivate din mezenchim releva noi caractere ale diferentierii neuroectodermale si epiteliale. Se apreciaza astfel ca, translocatiile cromosomiale specifice sarcomului Ewing induc fuzionarea genei EWS cu un subset al membrilor familiei factorilor de transcriere ETS, cea mai comuna fiind gena FLI-1 si mai putin frecvent, genele ERG, ETV-1, E1A-F sau FEV. Aceste proteine de fuziune se crede ca actioneaza ca factori de transcriere aberanti ce cupleaza la DNA prin domeniile de cuplare la DNA-ETS.
Recent s-a relatat ca TGF-beta RII, o gena supresoare de tumori, este o tinta a proteinei de fuziune EWS/FLI-1. Analiza efectelor proteinelor fuzionate EWS-ETV-1 si EWS-ERG asupra expresiei genei TGF-beta RII arata ca în celulele NIH 3T3 exista nivele scazute de mRNA si proteina ale acestei gene, ca de altfel si în liniile celulare cu sensibilitate redusa la TGF-beta. Aceste gene de fuziune supreseaza promotorul TGF-beta RII si activitatea indusa de FLI-1, ERG sau ETV-1. Represia transcriptionala a genei TGF-beta RII reprezinta o tinta importanta a oncogenelor EWS/FLI-1, EWS-ERG sau EWS-ETV-1 si deci, fuziunea proteinelor EWS-ETS poate functiona ca forma dominant negativa a factorilor de transcriere ets.
Tumorile Ewing sunt malignitati umane primare ale tesuturilor dure (os) si moi, caracterizate la cel putin 95% din cazuri, prin transcripte specifice de fuziune cu originea în translocatiile cromosomiale recurente. Protocolul clinic pentru tumorile Ewing cu înalt risc de metastazare include chemoterapia si radioterapia cu doze înalte, urmate de reinfuzia cu celule stem din sângele periferic (PBSC).

FAMILIA GENELOR SKI (part 1)

codugenetic — Sun, 24 Aug 2008 11:42:51 GMT

Autori: Dumitru Miscalencu; Camelia Iancu; Florica Mailat; Ilinca Nicolae articol preluat de pe www.ebooks.unibuc.ro

FAMILIA GENELOR SKI

Din aceasta familie fac parte protooncogenele ski, sno si smad-3.

Gena ski

Protooncogena ski codifica o proteina nucleara care poate actiona ca factor de transcriere. Proteina Ski se exprima în liniile de limfocite B si T, în macrofage mature si în mastocite. Expresia mRNA ski atinge maximum în faza G1 în celulele sincronizate deprivate de leucina în prezenta factorilor de crestere, dar scade rapid când acestia sunt îndepartati. Se sugereaza ca protooncogena ski ca si sno care sunt membri ai acestei familii arata proprietati diferite intervenind în hemopoieza, raspund la factori de crestere si regleaza ciclul celular
Gena ski este localizata pe cromosomul 1( 1 q12-q21-c-ski ). Analiza acestei gene în 6 linii de melanom nu arata alterarea sa. Transcriptele în liniile celulare normale au nivele sensibil mai scazute decât în celulele liniilor de melanom, astfel ca aceste nivele pot juca un rol în transforamarea melanocitelor în celule tumorale de melanom
Protooncogena ski intervine în proliferarea celulelor în timpul morfogenezei si în diferentierea miogenica, exprimându-se astfel în mioblastele embrionare. Transcriptele protooncogenelor pot fi detectate timpuriu în somitele angajate miogenic, ca si în muschii scheletici diferentiati. Totusi mRNA c-ski exprimat în celulele liniei miogene nu se disting de transcriptele c-ski din alte linii celulare, aparând probabilitatea ca cele specific musculare sa fie exprimate tranzitoriu.
Experimentele efectuate pe liniile aviare QM7 si QM5 în timpul diferentierii musculaturii, au demonstrat ca nivelul expresiei si splicingul (procesarea) alternativ al treptelor c-ski ramân neschimbate atât în timpul opririi ciclului celular, cât si în timpul diferentierii miogenice.
S-a constatat ca protooncogena c-ski se exprima în uterul de sobolan în timpul estrului, mRNA c-ski fiind detectat principalmente în epiteliul glandular. În ideea testarii posibilitatii ca expresia mRNA c-ski sa fie indusa de estrogeni, sobolanii au fost ovarectomizati si injectati cu estradiol 17 beta. Expresia mRNA c-ski s-a reglat la 3 ore dupa injectare, atingând maximum la 6 ore si persistând pâna la 24 de ore. De aici concluzia ca c-ski joaca un rol important în proliferarea epiteliului uterin si mediaza activitatea proliferativa a extradiolului 17 beta. În ontogenia soarecilor, protooncogena c-ski se exprima la nivele scazute în toate celulele. În unele celule si tesuturi însa, gena se exprima la nivele înalte în câteva stadii atât ale dezvoltarii embrionare cât si a celei postnatale.
La embrion celulele crestelor neurale exprima c-ski în timpul migrarii la 8-9 zile post-coitum. Derivatele crestelor neurale, asa cum sunt ganglionii radacinilor dorsale ale nervilor rahidieni si melanocitele, reactioneaza pozitiv la un anticorp anti-proteina Ski. La 9 zile, întregul tub neural arata înalte nivele ale expresiei genei c-ski, iar la 14-16 zile mRNA c-ski este detectat, de asemenea la nivele înalte, în cortexul telencefalului si în bulbii olfactivi. La doua si sase saptamâni postnatal, creierul arata tanscripte ale genei c-ski în hipocamp si în stratul granular al cortexului cerebelos.
Se sugereaza ca c-ski joaca un rol atât în proliferarea cât si în diferentierea populatiilor celulare specifice sistemului nervos central si periferic.
Tesutul pulmonar neonatal arata nivele ale expresiei genei de doua ori mai crescute decât nivelele prenatale.
Hiperexpresia v-ski blocheaza diferentierea terminala a eritroblastelor de pui si în cooperare cu v-sea cauzeaza transformarea acestor celule sugerând ca c-ski joaca un rol în reglarea proliferarii sau diferentierii celulelor hemopoietice. Actionând cu PMA asupra a 4 linii de celule mieloide s-a demonstrat ca acesta regleaza mRNA c-ski numai în liniile care raspund prin diferentierea seriei megacariocitice. Extinderea diferentierii si cresterea mRNA c-ski se coreleaza cu concentratia PMA folosita pentru inducerea diferentierii. De aici sugestia ca, expresia c-ski se coreleaza cu maturarea magacariocitelor.

Gena sno

Gena sno este o noua gena celulara ce apartine familiei ski. Are 12 kb si contine 6 exoni din care primul este necodificant. Secventele aminoacid codificate de primul exon al c-sno, ca de altfel si al c-ski, sunt înalt înrudite. Regiunea promotoriala este bogata în G+C dar nu contine locusurile TATAA sau CAAT. Locurile potentiale de cuplare pentru factorii de transcriere SP1, AP1 si AP2 sunt prezente amonte de startul de transcriere.
În celule mature expresia protooncogenei sno este mai limitata decât a lui ski si se exprima în celulele T dar nu în celulele B, iar în progenitorii mieloizi este mai larg exprimata decât protooncogena ski. Expresia mRNA sno este maxima în faza G1 timpurie si ulterior oscileaza pe parcursul ciclului celular.
Protooncogena sno este implicata în dezvoltarea muschilor; ea detine 1330 nucleotide, iar izoformele sale procesate alternativ sunt Sno N de 684 aminoacizi, Sno A de 415 aminoacizi si Sno I de 399 aminoacizi (44, 298 MW). O singura gena sno poate exprima cele trei izoforme prin procesare alternativa si toate trei contin regiunea cu cele mai multe similaritati cu protooncogena ski. Secventa Sno I specific umana este prezenta si la câteva specii de mamifere (maimuta, câine, vaca, iepure, porc), dar nu la rozatoare, în timp ce secventa comuna a acestei gene este conservata la toate speciile de vertebrate terestre.
mRNA sno N, sno A si ski se acumuleaza în multe tesuturi umane printre care si muschii scheletici. mRNA sno I alternativ se acumuleaza mai specific în acestia, dar si în rabdomioscarcom-tumora a muschilor scheletici. Procesarea alternativa tesut-specifica a acestei gene umane rezulta într-un mRNA din familia genei ski/sno, pe de o parte, si prezenta mRNA sno în muschi pe de alta parte, au rol în reglarea genelor responsabile de formarea muschilor.

FAMILIA GENELOR SKI (part 2)

codugenetic — Sun, 24 Aug 2008 11:40:57 GMT

Autori: Dumitru Miscalencu; Camelia Iancu; Florica Mailat; Ilinca Nicolae articol preluat de pe www.ebooks.unibuc.ro

Gena smad-3

TGF-beta induce o varietate de raspunsuri fiziologice cum sunt inhibarea cresterii, a diferentierii si apoptoza. De asemenea, induce fosforilarea si translocatia nucleara a genei smad-3. Ca raspuns la activarea semnalizarii TGF-beta s-a constatat asocierea nucleara a genei smad-3 cu proteina nucleara a protooncogenei ski. Aceasta asociere represeaza activitatea transcriptionala indusa de smad-3, ca si hiperexpresia protooncogenei ski, ceea ce confera celulelor rezistenta la efectele lui TGF-beta de inhibare a cresterii. Represia transcriptionala ca si rezistenta la crestere induse de TGF-beta prin hiperexpresia ski, pot fi exprimate prin hiperexpresia lui smad-3. În acest context ski apare ca un nou component al caii de semnalizare TGF-beta relevând astfel mecanismele sale de actiune.
Cuplarea TGF-beta la receptorul sau induce fosforilarea lui smad-3 care ulterior migreaza în nucleu unde functioneaza ca un factor de transcriere. Hiperexpresia asocierii lui smad-3 cu proteina de transcriere a protooncogenei sno N represeaza activarea transcriptionala a smad-3. Activitatea de semnalizare a TGF-beta duce însa, la degradarea rapida a sno N si mai putin a proteinei înrudite ski, degradare mediata de proteosomii celulari.
Proteinele Smad sunt mediatori de semnalizare intracelulara ai superfamiliei TGF-beta care regleaza o vasta varietate de procese biologice. Printre acesti mediatori se numara smad-2 si smad-3 care sunt activati specific de TGF-beta. Acesti doi mediatori interactioneaza cu c-ski prin domeniul C-terminal în maniera dependenta de TGF-beta. C-ski detine doua locuri distincte de cuplare pentru smad inhibând astfel puternic trnsactivarea a variate gene reporter via TGF-beta. C-ski este încorporat în comlexe cu smad, complexe care cupleaza la DNA, interfera cu interactiunea smad-3 -p300, un coactivator transcriptional si în replica recruteaza histone deacetilaza (HDAC). Astfel, c-ski devine un corepresor transcriptional care leaga proteinele la HDAC în calea semnalizarii TGF-beta.
Complexul N-CoR/SMRT care contine m Sin 3A si HDAC mediaza represia transcriptionala prin receptorul hormonal nuclear si prin Mad. Proteinele codificate de protooncogenele familiei ski cupleza direct la acest complex si la m Sin 3A formând astfel un complex cu HDAC. C-ski si produsul genei înrudite sno sunt reclamate pentru represia transcriptionala via Mad si receptorului hormonului tiroid (TR beta ). Forma oncogena v-ski care nu detine domeniul de cuplare pentru m Sin 3A actioneaza într-o maniera dominant negativa si abroga represia transcriptionala via Mad si TR beta. Astfel, ski devine un component al complexului HDAC si astfel este reclamat pentru represia transcriptionala mediata de acest complex. Implicarea lui c-ski în complexul HDAC indica faptul ca functia acestuia este importanta pentru oncogeneza.
Folosindu-se extract nuclear din celulele transformate de ski, s-a identificat un loc de cuplare la DNA specific pentru ski continând secventa consens GTCTAGAC. În extractele nucleare c-ski si v-ski exista componente ale complexelor care cupleaza specific la acest loc. S-a demonstrat ca ski represeaza transcrierea fie prin copii amonte ale acestui element, fie când promotorul poarta un domeniu heterolog de cuplare la DNA.